對于組織培養(yǎng)中生長的細胞，zui有效的裂解方法是用去污劑進行處理。雖然有多種去污劑可用于裂解細胞，但zui常用的是TritonX—100或NP—40等非離子型去污劑。非離子型去污劑能溶解胞質和細胞膜，破壞分子間許多微弱的結合鍵，并能溶解大部分經(jīng)常研究的蛋白質抗原，但對于大分子多聚抗原則無效，在大多數(shù)情況下該抗原也是難以研究的。濃度介于0．1％～1％的去污劑即可滿足幾乎所有溶解需求。非離子型去污劑裂解液一般補充等離子濃度的鹽和接近中性的pH。
在某些情況下，需要較劇烈的抽提條件以釋出所研究的抗原或除去微弱的相關蛋白。此時，推薦使用RIPA裂解緩沖液，該體系含離子型和非離子型去污劑，具有相當大的變性能力。除細胞內(nèi)不溶性蛋白外所有可溶性蛋白分子均可釋出，并能破壞大部分非共價的相互作用。
除非有特殊原因，推薦在裂解緩沖體系中加入蛋白酶抑制劑混合液。在新抗原研究的早期使用蛋白酶抑制劑總是有利的。在該蛋白已被定性后，可以進行實驗以了解這些抑制劑是否在所有情況下都必需。如前所述，終止蛋白酶作用的方法是在免疫沉淀的全部過程中溶液保持低溫。
如果研究經(jīng)磷酸化修飾的
蛋白質時，應考慮加入磷酸酶抑制劑。
1．準備工作
由于免疫沉淀有多個步驟，且包括數(shù)小時孵育，因此在實驗開始前必須安排好時間，注意適當利用過夜孵育的時間間隔。這將有助于決定何時開始裂解細胞。
2．所需溶液
PBS，裂解緩沖液（4℃預冷）。
3．操作步驟
（1）單層細胞的培養(yǎng)，用室溫PBS洗細胞一次，然后甩干；懸浮培養(yǎng)的細胞，400g離心10min，收集細胞棄上清液。
（2）對于單層細胞培養(yǎng)，將培養(yǎng)瓶置于冰上，每lOOmm培養(yǎng)瓶加入1 mL溶解緩沖液（4℃預冷）；對于懸浮培養(yǎng)，將盛細胞團的試管置于冰上。按107個細胞加入1．0ml裂解液（4℃預冷）。
保存在冰箱的裂解液可隨時使用。
（3）冰上放置3min，不時敲擊貼壁細胞培養(yǎng)瓶，或輕搖懸浮培養(yǎng)細胞。
（4）對于單層細胞培養(yǎng)，敲擊培養(yǎng)瓶數(shù)次，混合均勻，在冰床上傾斜培養(yǎng)瓶使溶液集中于一側，然后將裂解物移置另一支1．5mL圓錐形試管。有些研究者喜歡從瓶壁刮取細胞，但除特殊要求外此舉并非必須。
（5）單層培養(yǎng)的細胞或懸浮培養(yǎng)的細胞均以10 000g，413離心10min，仔細吸取上清液盛于另一試管，不可攪動細胞團。置冰上。
此時，上清液可用于下一步的預處理。
4．常見問題
上述程序zui普遍的問題是抗原不*從細胞內(nèi)釋放。可以通過對裂解液和細胞殘渣進行免疫印跡來檢查抗原是否*釋放。改變裂解液所用的去污劑是增加抗原釋放的zui有效方法。
機械性剪切也可破壞細胞膜，常見的方法包括使用超聲波發(fā)生器、Dounce勻漿器、波特器和攪拌器等。這些方法特別適用于大體積制備或需避免使用去污劑時。在這些方法中，zui溫和的方法是使用Dounce勻漿器，但僅適合于較大體積的標本（數(shù)毫升或更多）。
一般不推薦凍融法，因反復凍融會使蛋白質過量降解，其原因不明。除非所研究的抗原特別能耐受蛋白水解作用或者事先已測試過該方法，一般不作為。通常，用去污劑裂解是免疫沉淀的方法。
更新時間：2012-10-08
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